Как проверить молочные железы самостоятельно: Как проверить женскую грудь на онкологию без визита к маммологу

Мероприятия
проводятся в рамках Всемирного
дня борьбы против рака молочной железы.

Самообледование молочных желез | ГУЗ Городской родильный дом г.Чита

Пользуясь порталом «ГОРОДСКОЙ РОДИЛЬНЫЙ ДОМ»,

Вы автоматически соглашаетесь с Правилами публикаций отзывов на сайте roddom-chita.ru

1.Общие положения:

1.1. Настоящие Правила регламентируют порядок размещения отзывов посетителей (пользователей) сайта roddom-chita. ru (далее – Сайт).

1.2. Посетители, приславшие отзывы для размещения на Сайте, (авторы отзывов), безвозмездно передают Администрации Сайта право свободного использования и предоставления широкого доступа к этим отзывам в пределах данного ресурса. Администрация Сайта оставляет за собой право использовать отзыв по собственному усмотрению и размещать его на других ресурсах (в печатных изданиях, на электронных носителях и т.д.).

2. Порядок публикации отзывов:

2.1. Администрация Сайта вправе самостоятельно и без уведомления пользователей отбирать отзывы для публикации, самостоятельно определять срок, в течение которого отзывы будут считаться актуальными.

2.2. До публикации отзыв проверяется Администрацией Сайта на соответствие настоящим Правилам, после чего Администрация Сайта принимает решение о его публикации.

2.3. Отзывы публикуются и используются без редактирования и поправок с сохранением авторской грамматики и пунктуации. Исключение составляет исправление явных опечаток.

2.4. В отзывах допускается только констатация и описание фактов, которые произошли с автором отзыва при обращении в ГУЗ «Городской родильный дом»

2.5. Отзывы без указания контактных данных (реальный e-mail пользователя, номер телефона и т.д.) считаются анонимными и на сайте не размещаются. В случае размещения такого отзыва, он наделяется пометкой: «Анонимный отзыв. Может содержать сведения, полностью не соответствующие действительности».

2.6. При размещении отзыва на Сайте администрация указывает исключительно имя автора отзыва. Контактные данные (реальный e-mail пользователя, номер телефона и т.д.) на страницах Сайта не указываются и не отображаются.

Контактными данными автора отзыва может воспользоваться исключительно Администрация сайта roddom-chita.ru для уточнения каких-либо данных, связанных с рассмотрением отзыва.

2.7. Администрация Сайта оставляет за собой право не публиковать отзыв пользователя, а также удалить с Сайта любой ранее опубликованный отзыв без объяснения причин и предупреждений в любое время.

2.8. В случае, если пользователь в будущем пожелает удалить свой отзыв с сайта roddom-chita.ru, он должен отправить запрос на удаление по адресу [email protected].

3. На сайте roddom-chita.ru не публикуются отзывы:

3.1. содержащие информацию, являющуюся клеветнической, дискредитирующей или угрожающей;

3.2. содержащие информацию, оскорбляющую честь и достоинство, а также национальные и религиозные чувства людей;

3.3. содержащие имена и другие персональные данные конкретных личностей, за исключением фамилии, имени, отчества медицинского работника ГУЗ «Городской родильный дом», в отношении которого написан отзыв;

3.4. содержащие ненормативную лексику, высказывания оскорбительного характера и т.д.;

3.5. представляющие собой явную коммерческую рекламу, содержащие спам, контакты организаций и ссылки на сайты;

3.6. содержащие информацию, не относящуюся к деятельности ГУЗ «Городской родильный дом»;

3.7. содержащие призывы или агитацию не пользоваться услугами ГУЗ «Городской родильный дом»;

3. 8. содержащие заведомо недостоверную информацию, призванную оттолкнуть клиентов от ГУЗ «Городской родильный дом»;

3.9. содержащие информацию о сравнении ГУЗ «Городской родильный дом» с другими юридическими лицами;

3.10. содержащие ссылки на отзывы, размещенные пользователями на других сайтах;

3.11. малоинформативные и необъективные.

4. Ответственность:

4.1. За содержание и достоверность информации в отзывах, размещаемых пользователями на сайте roddom-chita.ru, а также за нарушение прав третьих лиц, пользователь, разместивший данную информацию, несет ответственность самостоятельно.

4.2. Портал roddom-chita.ru, не является соавтором и распространителем данной информации, а лишь предоставляет площадку для ее размещения. Публикация отзыва на сайте не означает, что мнение Администрации сайта совпадает с мнением посетителя, оставившего отзыв. Администрация сайта не несет ответственности за достоверность сведений, содержащихся в отзывах.

4. 3. В случае, возникновения претензий к пользователям, разместившим информацию, о достоверности размещенной информации, а также в случае, если размещенная информация, нарушает чьи либо права, портал обязуется, согласно действующему законодательству Российской Федерации, раскрыть всю имеющуюся информацию о данном пользователе (контактные данные (e-mail пользователя, номер телефона и т.д.)), в срок, предусмотренный законом.

5. Прочие условия:

5.1. Администрация сайта roddom-chita.ru оставляет за собой право на внесение изменений и дополнений в настоящие Правила в любой момент времени без уведомления посетителей (пользователей) Сайта. Изменения вступают в силу с момента их публикации.

Анатомия груди: рак груди, грудное вскармливание, условия

Что такое грудь?

Грудь является частью женской и мужской половой анатомии. У женщин грудь одновременно функциональна (для кормления грудью) и сексуальна (доставляет удовольствие). У мужской груди нет функции. Видимые части анатомии груди включают соски и ареолы.

Из чего сделана грудь?

Женская грудь формируется из нескольких видов тканей. Мышцы соединяют грудь с ребрами, но они не являются частью анатомии груди.К различным типам тканей груди относятся:

• Железистая ткань: Железистая ткань, также называемая дольками, вырабатывает молоко.
• Жирность: Эта ткань определяет размер груди.
• Соединительная или волокнистая: Эта ткань удерживает железистую и жировую ткань груди на месте.

Какие части составляют анатомию груди?

Анатомия женской груди состоит из множества различных частей, в том числе:

• Доли: Каждая грудь имеет от 15 до 20 долей или секций.Эти лепестки окружают сосок, как спицы колеса.
• Железистая ткань (дольки): Эти небольшие участки ткани, находящиеся внутри долей, имеют крошечные луковичные железы на конце, которые производят молоко.
• Молочные (молочные) протоки: Эти маленькие трубочки или протоки несут молоко от железистой ткани (дольки) к соскам.
• Соски: Соска находится в центре ареолы. В каждом соске около девяти молочных протоков, а также нервов.
• Ареолы: Ареола — это круглая область кожи темного цвета, окружающая сосок.У ареол есть железы, называемые железами Монтгомери, которые выделяют смазочное масло. Это масло защищает соски и кожу от натирания во время кормления грудью.
• Кровеносные сосуды: Кровеносные сосуды обеспечивают циркуляцию крови по груди, груди и телу.
• Лимфатические сосуды: Являясь частью лимфатической системы, эти сосуды транспортируют лимфу, жидкость, которая помогает иммунной системе вашего организма бороться с инфекциями. Лимфатические сосуды соединяются с лимфатическими узлами или железами, находящимися под подмышками, в груди и других местах.
• Нервы: Соски имеют сотни нервных окончаний, что делает их чрезвычайно чувствительными к прикосновениям и возбуждению.

А мужская грудь?

У мужчин тоже есть грудь. В период полового созревания мужской гормон тестостерон обычно не дает груди развиваться, как женской. Снаружи у самцов есть соски и ареолы. Внутри у них неразвиты молочные протоки и нет железистой ткани. Проблемы с мужской грудью могут включать гинекомастию, доброкачественное заболевание, которое вызывает увеличение груди, и очень редко — рак груди.

Что такое плотная грудь?

В отчете о маммографии может быть указано, что у вас плотная грудь. Плотная грудь имеет больше железистой и фиброзной ткани и меньше жировой ткани. Плотная ткань груди и опухоли на маммограмме выглядят белыми, что затрудняет выявление рака груди. До половины женщин в возрасте от 40 до 74 лет имеют плотную грудь. Состояние не связано с размером груди, внешним видом или ощущением на ощупь. У женщин с очень плотной грудью риск рака груди несколько выше.

Как работает грудь?

Женские гормоны, а именно эстроген, прогестерон и пролактин, играют ключевую роль в развитии и функционировании груди.

• Эстроген растягивает молочные протоки и помогает им образовывать боковые ответвления для переноса большего количества молока.
• Пролактин способствует выработке прогестерона и подготавливает железы к производству молока.
• Прогестерон увеличивает количество и размер долек при подготовке к кормлению грудью. Этот гормон также увеличивает кровеносные сосуды и клетки груди после овуляции.Вы можете почувствовать опухшие и болезненные груди.

Какие состояния и нарушения влияют на анатомию груди?

Рак груди — угроза номер один для здоровья груди. Примерно каждая восьмая женщина получит диагноз рака груди в течение своей жизни. Другие состояния, влияющие на здоровье груди, включают:

Как сохранить здоровье груди?

Поскольку рак груди является главной проблемой, поговорите со своим врачом о том, когда и как часто проходить маммографию. Рекомендации различаются в зависимости от факторов риска, таких как семейный анамнез заболевания. Самообследование груди поможет вам лучше понять, как выглядит и ощущается ваша грудь, чтобы вам было легче заметить изменения или потенциальные проблемы.

Когда мне позвонить врачу?

Вы должны позвонить своему врачу, если у вас возникли проблемы:

• Недавно обнаруженная шишка.
• Выделение из соска.
• Боль в груди.
• Изменения в том, как выглядит или ощущается ваша грудь или кожа.
• Ниппель, который внезапно поворачивается внутрь (втянутый сосок).
• Сыпь на груди.

Записка из клиники Кливленда

Женская грудь может производить молоко для кормления грудью, а также служить эрогенной зоной (зоной удовольствия). Грудь формируется из разных тканей. Эти ткани могут стать злокачественными. Регулярные маммограммы или обследования груди могут помочь обнаружить рак на ранней стадии, когда он наиболее поддается лечению. Звоните своему врачу в любое время, когда заметите изменение внешнего вида или ощущения вашей груди.

Способ получения генетически модифицированной молочной железы мыши | Исследование рака молочной железы

Мыши

Для анализа трансплантации в качестве мышей-реципиентов использовали rag2 ^{— / —} (любезно предоставлено доктором Такаки) линии мышей-альбиносов с ослабленным иммунитетом, подвергнутые обратному скрещиванию с FVB или C57BL / 6J. В качестве доноров использовали мышей FVB или C57BL / 6J.

Конструирование и получение вектора

Все векторы были сконструированы с использованием набора для лигазной реакции (Nippon Gene, Токио, Япония или Takara, Киото, Япония) или набора для реакции In-Fusion (Takara).В случае загрузки ВАС длинного транспозонного донорного вектора (фиг. 5a) матричный вектор сначала был сконструирован путем соединения шести фрагментов с использованием реакции In-Fusion после обеспечения каждого фрагмента с помощью полимеразной цепной реакции или отжига 2-олигонуклеотидов ДНК. Содержимое этого вектора-шаблона изображено в нижней части рис. 5а. Здесь плечи длиной 70 и 134 п.о., гомологичные вектору ВАС (pBACe3.6), были помещены во фланкирующие области. Расщепленный фрагмент этого вектора-шаблона N ot I / B st XI (FastDigest от Thermo Scientific) в E.coli BAC clone B6Ng01-263 N07 (RIKEN BioResource Center (BRC)) путем электропорации, и реакцию гомологичной рекомбинации проводили с помощью системы RED / ET (Gene Bridges, Гейдельберг, Германия) для получения длинного транспозонного донорного вектора (рис. 5а).

Затем длинный донорный вектор транспозона очищали с использованием набора NucleoBond Xtra BAC (Macherey-Nagel, Takara). Другие векторы очищали с помощью седиментации на ультрацентрифуге в градиенте CsCl после очистки методом щелочного лизиса.

Культура клеток

Фибробласты, полученные из эмбрионов мыши, C3h20T1 / 2 (RCB0247; RIKEN BRC), культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Wako Pure Chemical Industries, Ltd. , Токио, Япония), содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки. (FBS), 100 мкг / мл сульфата стрептомицина (Meiji Seika Pharma, Токио, Япония) и 100 Ед / мл пенициллина G калия (Meiji Seika Pharma) при 37 ° C и 5% CO ₂ . Для совместного культивирования с MEC клетки C3h20T1 / 2 обрабатывали 4 мкг / мл митомицина C (Wako) в течение 3 часов и инкубировали в течение ночи при 5% CO ₂ и 37 ° C в течение 1-2 дней.

Клетки NMuMG культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 100 мкг / мл сульфата стрептомицина, 100 Ед / мл калия пенициллина G, 10 мкг / мл инсулина и 0,45% глюкозы.

Препарат клеток молочной железы

Грудные, брюшные и паховые молочные железы иссекали у самок мышей-доноров в возрасте 8–10 недель. После промывания в фосфатно-солевом буфере (PBS) ткани рубили бритвой. Затем ткани переваривали в течение 1-2 ч при 37 ° C при встряхивании в среде DMEM / F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), содержащей 5% FBS, 2 мг / мл коллагеназы IV (Sigma, Poole, UK), и 0. 1 мг / мл гиалуронидазы (Sigma). После удаления эритроцитов в DMEM / F12 повторным центрифугированием в условиях низкой плотности с последующим суспендированием в буфере ACK (0,15 M NH ₄ Cl, 10 мМ KHCO ₃ , 0,1 мМ EDTA, pH 7,3) суспензия диссоциированных клеток получали пипетированием в течение 8–10 мин в буфере для диссоциации клеток (PBS, 0,05% трипсин, 0,5 мМ EDTA, 0,5% DNaseI), а затем в течение 2 минут в диспазе 5 мг / мл (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада) –0,5 % DNaseI с последующей фильтрацией через сито 42 мкм.

Сортировка клеток

Суспензию диссоциированных одиночных клеток метили биотинилированными антителами CD45, Ter119, CD31 и BP-1, содержащимися в коктейле для обогащения эпителиальных клеток EasySep Mouse (StemCell Technologies), в течение 30 минут на льду и после промывки инкубировали с анти-CD49f-PE (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, США), анти-CD24-perCP-cy5.5 (eBioscience), стрептавидином-ECD (Beckman-Coulter, Бреа, Калифорния, США) и 7-амино- актиномицин D (7-AAD; Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния, США) в течение 30 мин на льду. Перед сортировкой клетки суспендировали в 2% сбалансированном солевом растворе FBS – Хэнка, включая ДНКазу. Сортировку клеток проводили с использованием метода сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) SH800 (Sony, Токио, Япония). CD45 ^— Ter119 ^— CD31 ^— BP-1 ^— (Lin (-)) 7-AAD ^— CD49f ^{высокий} Клетки CD24 ⁺ были собраны для представления фракции, обогащенной MaSC.

Трансфекция

Всего 1 × 10 ⁶ клеток отсортированной фракции, обогащенной MaSC, от примерно восьми мышей суспендировали и дважды промывали в Opti-MEM (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США).Затем 10 мкг ДНК донорного и вспомогательного вектора смешивали в соотношении 3: 1 с MEC в Opti-MEM и подвергали электропорации с использованием NEPA21 (NEPAGENE, Chiba, Tokyo) с кюветой для электродов с зазором 2 мм (NEPAGENE , EC-002S). Настройки для этой электропорации показаны в Дополнительном файле 1 (Таблица S1). После электропорации суспензию клеток немедленно суспендировали в культуральной среде.

Для трансфекции в NMuMG диссоциированные клетки высевали на шестилуночные планшеты при 20–30% конфлюэнтности за день до трансфекции.Донорные и вспомогательные векторы вводили при соотношении OD ₂₆₀ 3: 1 путем выливания смеси из 4 мкг ДНК и 8–12 мкг полиэтиленимина (Polysciences, Warrington, PA) в 200 мкл Opti-MEM.

Система культивирования для поддержания стволовости MaSC

MEC были совместно культивированы с обработанным митомицином C C3h20T1 / 2 в DMEM / F12 с добавлением 10% FBS, 10 нг / мл фактора роста эпидермиса человека (hEGF; BD Biosciences, Токио, Япония), 5 мкг / мл инсулина (Wako), 0,5 мкг / мл гидрокортизона (Sigma), 5 мкМ форсколина (Wako), 1.8 × 10 ^-4 M аденин (Sigma), 100 мкг / мл стрептомицина (Meiji Seika Pharma), 100 Ед / мл пенициллина G (Meiji Seika Pharma), 50 мкг / мл гентамицина (Nakalai Tesque, Токио, Япония), 10 мкМ Rho-ассоциированного ингибитора киназы, образующего спиральную спираль (ROCKi; Y-27632; LC Laboratories, Нью-Бостон, Массачусетс, США) [20, 21], и 10% матригеля (сниженный фактор роста; BD Biosciences) в концентрации 5% CO ₂ и 37 ° C в течение 7 дней. Количество MEC и C3h20T1 / 2 составляло 5000 и 6,25 × 10 ⁴ соответственно в 250 мкл культуральной среды в 48-луночном планшете.Когда использовались лунки разного размера, эти числа менялись пропорционально площади лунки.

Анализ трансплантации

Трансфицированные МЭК в культуре обрабатывали диспазой в течение 1-2 часов при 37 ° C, а затем примерно 3% всех трансфицированных клеток суспендировали в 4–10 мкл DMEM / F12, включая 10% матригеля на трансплантацию. сайта и трансплантировали в очищенные жировые подушечки паховых молочных желез мышей rag2 ^{— / —} , у которых был удален эндогенный эпителий с помощью 50-мкл шприца, снабженного иглой 30-G (ITO, Сидзуока, Япония ).Репопуляцию молочных желез анализировали путем обнаружения биолюминесценции с использованием системы визуализации in vivo (IVIS Lumina XR, PerkinElmer, Waltham, MA, США) и флуоресценции mCherry с использованием стереомикроскопа (Leica, Wetzlar, Германия).

Окрашивание карминовыми квасцами

Рассеченные молочные железы распределяли на предметном стекле и фиксировали фиксатором Карнуа (60% этанол, 30% хлороформ и 10% ледяная уксусная кислота) в течение ночи при комнатной температуре. Фиксированные ткани промывали 70% этанолом, постепенно регидратировали до дистиллированной H ₂ O, а затем инкубировали в растворе карминных квасцов (0.2 мас.% Кармина (Sigma) и 0,5 мас.% Сульфата алюминия-калия (Wako) в дистиллированной H ₂ O) в течение от 2 часов до ночи при комнатной температуре. После постепенного обезвоживания от 70% этанола до 100% этанола жировые подушечки очищали в течение ночи в ксилоле и помещали в MGK-S (Мацунами, Осака, Япония).

Окрашивание гематоксилином и эозином

После промывания в PBS рассеченные молочные железы и опухоли фиксировали в 4% параформальдегид-PBS в течение ночи и в течение 2 дней соответственно. После промывки в PBS образцы постепенно дегидратировали от 70% этанола до 100% этанола, а затем от 50% ксилола в этаноле до 100% ксилола после замены парафина с использованием полностью автоматического процессора закрытых тканей Leica ASP300 и заливки парафином с помощью Leica EG1160 .Затем залитые в парафин ткани разрезали на срезы толщиной 5 мкм с помощью скользящего микротома Leica SM200R. Срезы постепенно депарафинизировали в ксилоле, а затем в этаноле, постепенно уменьшая содержание этанола от 100% до 50%, и промывали дистиллированным H ₂ O, а затем окрашивали в растворе гематоксилина (0,25% гематоксилин (Nacalai Tesque), 0,05% натрия йодат (Nacalai Tesque), 12,5% квасцов калия (Wako) и 0,25% лимонной кислоты (Wako)) в течение 10 мин. После промывки в дистиллированной H ₂ O срезы были воронены в 0.1% насыщенный карбонат лития при 37 ° C в течение 5 минут, затем промывали в дистиллированной H ₂ O и окрашивали в растворе эозина (1% эозина (Wako) и 0,02% ледяной уксусной кислоты) в течение 10 минут. После промывки в 90% и 100% этаноле срезы замачивали в ксилоле в течение 5 минут, а затем помещали в MGK-S (Matsunami).

Иммуногистохимия

Паховые молочные железы иссекали, разрезали на фрагменты размером ~ 1–5 мм ³ и предварительно фиксировали в течение 10–15 минут в 4% параформальдегиде-PBS на льду.Ткани промывали холодным PBS и инкубировали примерно 1 час в 10% сахарозе-PBS при 4 ° C, в течение примерно 1 часа в 20% -м сахарозе-PBS при 4 ° C и в течение ночи в 40% -м сахарозе-PBS при 4 ° C. . Ткани замораживали в среде криозакрепления [22] в жидком азоте. Затем замороженные блоки разрезали на секции толщиной 5 или 10 мкм с помощью криостата Leica CM1850. Срезы сушили в течение 1–10 мин при комнатной температуре, помещали более чем на 10 мин в PBS и затем фиксировали в течение 10–15 мин в 3% параформальдегиде при комнатной температуре.После промывания в течение более 10 минут в PBS или 0,1% Tween-PBS срезы инкубировали в блокирующем буфере (0,1% тритон / 10% козья сыворотка в PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C. Окрашивание первичными антителами проводили в течение ночи при 4 ° C или в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем срезы промывали трижды PBS или 0,1% Tween-PBS в течение 10 мин и окрашивали растворами вторичных антител, содержащими 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), в течение 1 ч при комнатной температуре.В случае окрашивания глобул молочного жира (MFG) срезы инкубировали в BODIPY 493/503 (3 мкг / мл; Molecular Probes), содержащем DAPI в PBS, в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем срезы дважды промывали PBS в течение 10 мин. Наконец, слайды были закреплены в MOWIOL DABCO.

Использовали следующие первичные антитела: анти-KRT14 (мышь, 1: 1000; Novocastra, Ньюкасл, Великобритания), анти-KRT8 (крыса, 1: 250; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa), анти-mCherry ( кролик, 1: 250; Abcam, Кембридж, Великобритания) и анти-PyMT (крыса, 1: 500; Санта-Крус, Калифорния, США).Также использовались следующие вторичные антитела: антимышиные, антикроличьи и крысиные, конъюгированные с AlexaFluor 488 (1: 1000; Molecular Probes, Юджин, Орегон, США) и AlexaFluor 568 (1: 1000; Molecular Probes). . Окрашивание ядер проводили с помощью DAPI (1: 4000; DOJINDO, Токио, Япония). Корректировку вариаций яркости и / или контрастности всей области изображений выполняли с помощью программы Photoshop (Adobe, Сан-Хосе, Калифорния, США).

Иммуноблоттинг

Клетки собирали в буфере RIPA (10 мМ трис-HCl (pH 8.0), 1% (мас. / Об.) NP40, 0,1% (мас. / Об. ) Дезоксихолат натрия (Wako), 0,1% ( мас. / Об. ) SDS (Wako), 0,15 M NaCl (Wako), 1 мМ EDTA, 10 мМ NaF (Wako), 1,5 мМ Na ₃ VO ₄ (Wako) и коктейль ингибиторов протеазы cOmplete ™ (Roche)). Концентрации белка определяли с использованием набора для анализа белка BCA (Thermo Fisher Scientific). Собранный белковый лизат смешивали с загрузочным буфером SDS-PAGE (0,15 М трис-HCl, 6% (мас. / Об.) SDS, 0,003% (мас. / Об.) Бромфенолового синего (Wako), 30% (мас. / Об.) Глицерина (Wako). ) и 15% (мас. / об.) β-меркаптоэтанола (Wako)), а затем кипятили при 95 ° C в течение 5 минут с последующим SDS-PAGE и иммуноблоттингом.Антитела, используемые для иммуноблоттинга, были следующими: анти-молоко (кролик, 1: 1000; Nordic-MUbio, Susteren, Нидерланды), анти-PyMT (крыса, 1: 500; Санта-Крус), анти-mCherry (кролик, 1: 500; Abcam), анти-гистон h4 (кролик, 1: 2500; Cell Signaling Technology, MA, США) и анти-α-тубулин (мышь, 1: 5000; Calbiochem).

Новое понимание морфогенеза молочной железы плода: дифференциальные эффекты природных и экологических эстрогенов

PMCA2 регулирует апоптоз во время инволюции молочной железы и предсказывает исход рака молочной железы

Abstract

После лактации отлучение от груди вызывает апоптоз эпителиальных клеток молочной железы (MEC).МЭК экспрессируют кальций-АТФазу 2 (PMCA2) плазматической мембраны, которая переносит кальций через апикальную поверхность клеток в молоко. Здесь мы показываем, что PMCA2 подавляется на ранних этапах инволюции молочных желез, связанных с изменениями формы MEC. Мы демонстрируем, что потеря экспрессии PMCA2 повышает уровень внутриклеточного кальция и повышает чувствительность МЭК к апоптозу. Напротив, сверхэкспрессия PMCA2 в клетках рака молочной железы T47D снижает внутриклеточный кальций и защищает их от апоптоза. Наконец, мы показываем, что высокая экспрессия PMCA2 при раке груди связана с плохим исходом.Мы пришли к выводу, что потеря экспрессии PMCA2 при отлучении от груди запускает апоптоз, вызывая клеточный кальциевый кризис. С другой стороны, сверхэкспрессия PMCA2 может играть роль в прогрессировании рака груди, обеспечивая устойчивость к апоптозу.

Молочная железа претерпевает драматический цикл развития и регресса во время репродукции (1). Девственная железа состоит из простой системы эпителиальных протоков. Во время беременности эпителиальные клетки молочной железы (МЭК) размножаются и образуют большое количество альвеол.Род вызывает полную секреторную дифференциацию и производство молока. После отлучения секреторные клетки удаляются, и железа перестраивается в систему протоков, которая напоминает состояние зрелых первородящих (1). Этот процесс инволюции молочной железы включает два последовательных раунда апоптоза. Первый происходит между 12 и 24 часами после отлучения от груди и вызывает потерю многих, но не всех секреторных эпителиальных клеток (2, 3). Эта фаза инволюции обратима, и лактация может продолжаться, если сосать грудь возобновить в течение 48 часов (2, 3).Однако, если железа остается незатронутой в течение более длительных периодов времени, наступает второй раунд апоптоза, связанный с необратимым ремоделированием ткани. Начальная волна апоптоза является результатом местных факторов, связанных с накоплением молока в альвеолах (молочный застой) (2), тогда как ремоделирование молочной железы происходит из-за вывода пролактина (2). Как застой молока вызывает апоптоз МЭК, остается неясным. Традиционно предлагалось два объяснения. Во-первых, было высказано предположение, что в отсутствие сосания растворимые факторы, такие как TGF-β (4), серотонин (5) и LIF (6), накапливаются и вызывают апоптоз.Во-вторых, была выдвинута гипотеза, что механическая деформация МЭК, вызванная растяжением альвеол, запускает апоптоз (7).

Производство молока требует транспорта большого количества кальция через эпителиальные клетки (8). Это создает проблемы для клеточного гомеостаза кальция. Уровень внутриклеточного кальция должен поддерживаться на низком уровне, потому что резкое повышение концентрации кальция в цитоплазме участвует в передаче сигнала (9), а стойкое повышение внутриклеточного кальция может вызвать клеточную дисфункцию и смерть (10–13). Фактически, многие пути апоптоза либо запускаются, либо приводят к токсичности внутриклеточного кальция (10–13). Кальций-АТФаза 2 (PMCA2) плазматической мембраны играет важную роль в транспорте кальция в молоко (8, 14, 15). Уровни мРНК PMCA2 увеличиваются в несколько сотен раз при функциональной дифференцировке МЭК во время лактации (14–16), и этот насос отвечает за транспортировку 60–70% молочного кальция (14, 15). Интересно, что уровни РНК и белка PMCA2 молочной железы резко падают после отлучения от груди (15, 17), что побудило некоторых исследователей предположить, что возникающее в результате нарушение экструзии кальция может привести к накоплению внутриклеточного кальция и способствовать апоптозу во время инволюции молочной железы (17, 18).В этом отчете мы приводим доказательства, демонстрирующие, что застой молока изменяет форму MEC и приводит к потере экспрессии PMCA2. Это, в свою очередь, нарушает внутриклеточный гомеостаз кальция и способствует инициации апоптоза в начале инволюции. Мы также сообщаем, что PMCA2 может защищать клетки рака молочной железы от апоптоза и что экспрессия PMCA2 в опухолях молочной железы коррелирует с клиническим исходом.

Результаты

Застой молока снижает экспрессию PMCA2.

Сначала мы исследовали экспрессию PMCA2 в ответ на застой молока.Для этих исследований мы закрыли одну соску кормящей мыши хирургическим клеем. Это вызывает накопление молока только в этой железе и запускает апоптоз МЭК в течение 24 часов (19). В незапечатанных железах не происходит апоптоза и нет изменений в системных уровнях гормонов (2). Мы измерили уровни белка PMCA2 и РНК в закрытых и контралатеральных, незапечатанных молочных железах с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, вестерн-блоттинга и количественной ОТ-ПЦР (qRT-PCR) (рис. 1). Уровни белка PMCA2 значительно снизились уже через 4 ч после индукции молочного застоя (рис.1 E и F ), задолго до начала апоптоза в этой модели (2) (рис. S1). Уровень мРНК значительно снизился к 12 часам (рис. 1 G ). Уровни белка PMCA2 и мРНК достигают своего надира через 24–48 ч (рис. 1 E — G ).

Рис. 1.

PMCA2 быстро подавляется застоем молока. Молочные железы собирали через 2, 4, 12, 24 и 48 ч после запечатывания сосков, чтобы вызвать застой молока. Незакрытая контралатеральная железа служила контролем. По сравнению с контрольной железой ( A ) иммунофлуоресцентное окрашивание на PMCA2 было менее интенсивным через 4 часа ( B ) и почти не определялось через 48 часов ( C ).( D ) Показано окрашивание 5 мкг / мл кроличьего IgG (Vector Labs) в качестве отрицательного контроля. Вестерн-блоттинг с 15 мкг мембранного белка на каждую железу ( E ) выявил уменьшение белка PMCA2 со временем в герметизированных железах, тогда как PMCA2 в незапечатанных железах не уменьшалось. Количественный анализ вестерн-блотов ( F ) показал, что уровни белка PMCA2 значительно снизились к 4 часам и продолжали снижаться до минимума к 24 часам. В открытых железах уровни PMCA2 существенно не различались в разные моменты времени.Уровни белка PMCA2 были нормализованы по экспрессии белка β-актина, и все временные точки в незапечатанных железах были усреднены вместе, чтобы установить исходный уровень. Затем средние уровни PMCA2 в каждый отдельный момент времени представляли как долю от базовых уровней. В запломбированных железах уровни PMCA2 в периоды увеличения после запечатывания ( F ) значительно различаются по данным однофакторного дисперсионного анализа ( P <0,0001), и посттест на линейный тренд был значимым при P = 0.0001, r ² = 0,8213. Аналогичным образом, уровни РНК PMCA2, измеренные с помощью qRT-PCR, были нормализованы до экспрессии Gapd , и все точки данных от незапечатанных желез были усреднены для установления исходного уровня. В ( G ) показаны уровни мРНК PMCA2 из запечатанных желез, представленные как фракция базовой экспрессии. Экспрессия гена PMCA2 значительно различалась со временем ( P = 0,0018) со значительным линейным трендом между временем после запечатывания и экспрессией PMCA2 ( P = 0. 0001, r ² = 0,7663). Столбики показывают среднее значение ± SEM для каждой группы. В ( F ) через 2, 12 и 24 часа n = 4; через 4 часа n = 6; и через 48 часов n = 5. В ( G ) n = 3 во все моменты времени. Значимые отличия от 2-часовой временной точки по посттесту Ньюмана-Кеулса обозначены * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001.

Накопление молока в альвеолах запечатанной железы было связано с очевидными изменениями формы клеток, показанными на рис.2 A — D путем окрашивания актинового цитоскелета фаллоидином. Во время лактации (Рис. 2 A и B ) эпителиальные клетки имеют столбчатую форму, демонстрируют заметное вздутие своих апикальных поверхностей на стыках клеток и обладают толстой сетью апикального подкоркового актина. После герметизации сосков клетки стали уплощенными, складки между клетками исчезли, а апикальная актиновая сеть стала тоньше (рис. 2 C и D ). Это «растяжение» эпителиальных клеток отражалось в прогрессивном увеличении их отношения площади поверхности к объему (SA: V) (рис.2 G ). Учитывая связь между формой клеток и уровнями PMCA2 in vivo, мы затем исследовали взаимосвязь между экспрессией PMCA2 и формой клеток в MECs in vitro. МЭК, выращенные в трехмерной культуре на обогащенной ламинином восстановленной базальной мембране (lrBM), организуются в сферы секреторных эпителиальных клеток, известные как маммосферы, тогда как MEC, выращенные на пластике или с высокой плотностью на тонком слое lrBM, образуют сплющенные монослои. Передача сигналов как интегрина, так и пролактина способствует дифференцировке MEC in vivo и на lrBM (19, 20).Однако, как видно на фиг. 2 H и J , экспрессия РНК и белка PMCA2 была низкой в ​​первичных эпителиальных клетках молочной железы, выращенных в монослое на пластике или на тонком слое lrBM, независимо от присутствия или отсутствия пролактина. В отсутствие пролактина клетки, выращенные в 3D-культуре, экспрессировали несколько больше PMCA2, но в присутствии пролактина MECs в 3D-культуре экспрессировали высокие уровни PMCA2. Клетки, выращенные на тонком lrBM в 2D, имели выраженные стрессовые волокна, очень мало кортикального актина и плоскую морфологию с высоким соотношением SA: V.Однако в 3D они имели выраженный кортикальный актин и были более столбчатыми с более низким соотношением SA: V. Эти данные предполагают, что форма и / или деформация клеток взаимодействуют с передачей сигналов пролактина и интегрина, чтобы регулировать экспрессию PMCA2. Чтобы определить, может ли механическая деформация МЭК напрямую влиять на уровни PMCA2, мы исследовали эффекты гипосмотического отека (21). Как показано на фиг. 2 H — J , воздействие на МЭК в трехмерной культуре гипосмотической среды значительно снижает уровни белка и мРНК PMCA2.Таким образом, в трех отдельных экспериментальных моделях, модели молочного застоя с уплотнением сосков, трехмерной и двумерной культуре эпителиальных клеток молочных желез и гипосмотическом набухании уровни PMCA2 были снижены за счет растяжения MEC, что позволяет предположить, что форма клеток может регулировать экспрессию PMCA2.

Рис. 2.

уровней PMCA2 связаны с формой ячейки. Незапечатанные ( A и B ) и запечатанные ( C и D ) молочные железы, а также 3D и 2D культуры MMEC ( E и F соответственно) были окрашены Alexa-488. -фаллоидин для визуализации микрофиламентов.Морфометрические измерения ( G ) показали, что отношение площади поверхности к объему (SA: V) было значительно выше в герметизированных молочных железах и что эпителиальный слой становился тоньше по мере накопления молока в течение 24 часов. Каждая точка в G представляет собой измерение альвеол в одном отдельном поле зрения. Однофакторный дисперсионный анализ дал общее значение P <0,0001, а посттест множественного сравнения Ньюмана-Кеулса показал значительные различия между незапечатанными и запечатанными железами (через 4 и 24 часа) и между запечатанными железами при 4 и 4.24 часа (без запечатывания 4 часа n = 6; запечатанный 4 часа, n = 5; без запечатывания 24 часа, n = 10; запечатанный 24 часа, n = 9). Кроме того, MMEC, выращенные в 2D на lrBM, были тоньше, чем MMEC, выращенные в 3D ( P = 0,0211, n = 3). Тест Стьюдента t Значения P показаны над столбиками на графике g. Вестерн-блоттинг 100 мкг (дорожки 1–5) или 50 мкг (дорожки 6–9) общего белка ( H ) и qRT-PCR ( J ) показывают, что для максимальной экспрессии PMCA2 в MMEC требуется пролактин (PRL) и культура в 3D на lrBM.Уровни PMCA2 были снижены ( P = 0,0033 для белка, P = 0,0034 для РНК) механической деформацией культур 3D MMEC с 50% гипосмотической обработкой в ​​течение 4 часов ( H – J ). Для белка + PRL n = 3; + ПРЛ с 50% гипосмотической средой, n = 3. Для РНК, пластик –PRL, n = 7; пластик + ПРЛ, n = 8; 2D lrBM −PRL, n = 8; 2D lrBM + PRL, n = 8; 3D lrBM −PRL, n = 3; 3D lrBM + PRL, н = 6; 3D lrBM + PRL с 50% гипосмотической средой, n = 3.Показаны средние значения ± SEM с отдельными точками данных для G и I .

Отсутствие PMCA2 вызывает апоптоз MEC.

Затем мы исследовали влияние дефицита PMCA2 на развитие молочных желез у мышей, несущих нулевую мутацию deafwaddler-2J (dfw-2J) в гене Atp2b2 (кодирующем PMCA2) (22). Хотя PMCA2 экспрессируется на низких уровнях эпителиальными клетками протоков, развитие молочной железы было неизменным до поздней беременности, когда уровни PMCA2 обычно повышаются как в протоковых, так и в альвеолярных клетках.Как показано на фиг. 3 A и B , к концу беременности альвеолярные структуры в железах dfw-2J казались меньше, чем у контрольных однопометников, разница, которая сохранялась в период лактации. Несмотря на уменьшение альвеолярной массы, мыши dfw-2J лактировали и поддерживали своих детенышей (15). MEC Dfw-2J пролиферировали и дифференцировались нормально во время беременности (фиг. S2), но окрашивание TUNEL выявило широко распространенный апоптоз на P18 (фиг. 3 C и D ).В железах dfw-2J 30,1 ± 10,0% клеток были TUNEL-положительными, хотя только 2,6 ± 1,2% клеток в контрольных железах были положительными. Наряду с апоптозом ранняя инволюция характеризуется характерными изменениями эпителиальной экспрессии ряда факторов транскрипции (23, 24). Как показано на рис. S3, они включают потерю ядерного фосфо-Stat5a (25) и индукцию ядерного фосфо-Stat3 (26) и NFκB (24). Подобно лактирующим железам, на P18 нормальные MECs экспрессировали ядерный фосфо-Stat5a, но не экспрессировали ядерный фосфо-Stat3 или NFκB.Однако на P18 эпителиальные клетки dfw-2J теряют ядерный фосфо-Stat5a и приобретают ядерный phsopho-Stat3 и NFκB, имитируя нормальные клетки во время инволюции. Таким образом, потеря PMCA2 привела к преждевременным изменениям в экспрессии фосфо-Stat5a, фосфо-Stat3 и NFκB, что сопровождалось широко распространенным апоптозом МЭК, имитирующим начальную фазу инволюции в конце беременности.

Рис. 3.

Недостаток PMCA2 вызывает апоптоз МЭК во время беременности. Молочные железы были взяты у гомозиготных мышей dfw-2J, у которых отсутствует экспрессия PMCA2, и мышей WT на 18 день беременности.Альвеолы ​​были меньше в целых образцах молочной железы, полученных от мышей dfw-2J ( B ), по сравнению с мышами WT ( A ). Окрашивание TUNEL молочных желез WT ( C ) и dfw-2J ( D ) на P18 выявило гораздо больше апоптотических ядер в железах dfw-2J, чем в железах WT. Первичные MMEC культивировали на lrBM с лактогенной средой и обрабатывали 5 мкМ иономицином (Invitrogen) или носителем в течение 16 часов перед анализом апоптоза с использованием ELISA ^PLUS (Roche) ( E ) на гибель клеток.MMEC WT в культуре 3D lrBM были относительно устойчивы к 5 мкМ иономицин-индуцированному внутриклеточному кальциевому стрессу ( E ), хотя в MMEC dfw-2J иономицин индуцировал апоптоз ( P = 0,0009; n = 4). Повышенный апоптоз в dfw-2J MMEC, обработанном 5 мкМ иономицином, связан с более высоким уровнем внутриклеточного кальция по сравнению с WT MMEC ( F ) ( P = 0,0384, WT n = 122 клетки в двух экспериментах, dfw -2J n = 51 клетка в двух экспериментах).Клетки визуализировали при перфузии стандартной средой в течение приблизительно 2 минут для определения исходного уровня кальция с последующей перфузией средой, содержащей 5 мкМ иономицин. Данные выражены как средний процент увеличения флуоресценции по сравнению с исходным уровнем. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± SEM.

Рис. 4. Сверхэкспрессия

PMCA2 защищает клетки рака молочной железы T47D от кальций-опосредованного апоптоза. Контрольные клетки T47D / EV или клетки T47D / PMCA2, сверхэкспрессирующие PMCA2, обрабатывали 5 мкМ иономицином в течение 16 часов в присутствии 0, 2 или 10 мМ внеклеточного CaCl ₂ перед оценкой апоптоза с помощью ELISA ^PLUS. ( А ).Увеличение внеклеточного кальция увеличивает индуцированный иономицином апоптоз в клетках T47D / EV и T47D / PMCA2. Однако сверхэкспрессия PMCA2 значительно снижает апоптоз. При 2 мМ и 10 мМ кальция общие значения однофакторного дисперсионного анализа ANOVA P были <0,0001. Тест Стьюдента t дал P = 0,0187 при 2 мМ кальция и P = 0,0308 при 10 мМ кальция для снижения апоптоза в T47D / PMCA2 по сравнению с клетками T47D / EV с иономицином. При 2 мМ кальция 5 мМ EGTA была способна предотвратить апоптоз, индуцированный иономицином ( B ).Однофакторный дисперсионный анализ ( P <0,0001 в целом, n = 4 для всех групп) с тестом множественного сравнения Ньюмана-Кеулса показал, что EGTA значительно ( P <0,05) снижает апоптоз, вызванный иономицином у T47D / EV ( P = 0,0064 на t тест) и клетки T47D / PMCA2 ( P = 0,0003 на t тест). Значительное снижение апоптоза по сравнению с обработанными иономицином клетками T47D / EV обозначено * (посттест Ньюмана-Кеулса, P <0.05, n = 4) в A и B . ( C ) Сверхэкспрессия PMCA2 изменила величину и форму внутриклеточного кальциевого ответа на лечение иономицином в клетках T47D ( P <0,0001 по парному тесту t для среднего значения 82 клеток T47D / EV и 87 T47D / PMCA2 из трех независимых экспериментов). ( D ) Активность кальпаина, указывающая на опосредованный кальцием апоптоз, была значительно увеличена иономицином в клетках T47D / EV ( P = 0.0305 однофакторный ANOVA, P <0,05 посттест Ньюмана-Кеулса, n = 3), тогда как избыточная экспрессия PMCA2 предотвращала повышение активности кальпаина в клетках T47D / PMCA2 ( P > 0,05 в посттесте Ньюмана-Кеулса) . Активность кальпаина также значительно увеличивается через 24 часа после начала инволюции ( P = 0,0298 по тесту Стьюдента t , n = 3) в закрытых и открытых молочных железах ( E ). ( F ) Сверхэкспрессия PMCA2 в клетках T47D / PMCA2 уменьшала апоптоз в ответ на лечение доцетакселом (5 нг / мл в течение 40 часов) по сравнению с контрольными клетками T47D / EV ( n = 9, P = 0.0199; четыре повтора в каждом из девяти независимых экспериментов). Столбики и линии представляют собой среднее значение ± SEM.

Время апоптоза MEC у мышей dfw-2J совпало с функциональной дифференцировкой MEC (27), которая также является точкой, в которой обычно увеличивается экспрессия PMCA2 (15). Вероятно, это также момент, когда поступление кальция в МЭК увеличивается при подготовке к началу производства молока. Поэтому мы предположили, что недостаток PMCA2 может привести к неспособности транспортировать повышенную нагрузку кальция, прогрессирующей внутриклеточной токсичности кальция и, в конечном итоге, к апоптозу.Чтобы проверить эту гипотезу, мы выращивали 3D-культуры первичных эпителиальных клеток молочной железы от мышей dfw-2J или контрольных мышей и оценивали их чувствительность к индуцированному кальцием апоптозу. На исходном уровне апоптоз имел тенденцию быть выше в клетках dfw-2J, чем в клетках WT, а приток кальция, вызванный обработкой иономицином, приводил к значительному увеличению апоптоза. Напротив, не наблюдалось увеличения апоптоза в контрольных клетках, подвергшихся воздействию иономицина (фиг. 3 E ). Аналогичным образом иономицин вызывал значительно большее повышение внутриклеточной концентрации кальция в клетках dfw-2J, чем в контрольных клетках (рис.3 F ). Следовательно, попадание кальция в MECs вызывает апоптоз в отсутствие PMCA2.

Сверхэкспрессия PMCA2 подавляет апоптоз в клетках рака молочной железы.

Если уровни PMCA2 регулируют чувствительность к индуцированному кальцием апоптозу в нормальных клетках груди, то сверхэкспрессия PMCA2 может защитить клетки рака груди от апоптоза. Мы решили изучить, влияет ли повышенная экспрессия PMCA2 на чувствительность клеток рака молочной железы T47D к индуцированному кальцием апоптозу. Хотя эти клетки экспрессируют более высокие уровни, чем нормальные клетки, клетки T47D экспрессируют более низкие исходные уровни PMCA2, чем несколько других стандартных клеточных линий.Клетки T47D трансфицировали конструкцией, кодирующей мышиный PMCA2b / w, для получения стабильной клеточной линии T47D / PMCA2 (фиг. S4). Линия контрольных клеток содержала пустой вектор (T47D / EV). В отсутствие внеклеточного кальция обработка иономицином вызвала небольшой апоптоз в клетках T47D / PMCA2 или T47D / EV. В клетках T47D / EV иономицин индуцировал прогрессирующее увеличение апоптоза при 2 мМ кальция и 10 мМ кальция. Однако как при 2 мМ, так и при 10 мМ кальция избыточная экспрессия PMCA2 значительно снижает апоптоз в ответ на иономицин в клетках T47D / PMCA2.Добавление EGTA к культуральной среде уменьшало апоптоз, индуцированный иономицином в клетках T47D / EV и T47D / PMCA2, подтверждая, что апоптоз зависел от проникновения внеклеточного кальция в клетки.

Рис. 5.

Высокая экспрессия PMCA2 предсказывает плохой исход в случаях рака груди у человека. ( A — C ) Используя базу данных Oncomine и инструменты интеллектуального анализа данных (www.oncomine.org), мы обнаружили связь между экспрессией PMCA2 (ген ATP2B2 ) и увеличением степени злокачественности опухоли груди ( A, P = 0). .004, корреляция Пирсона), смерть в течение 5 лет после постановки диагноза рака груди ( B , P = 0,043, t тест) и устойчивость к лечению доцетакселом ( C , P = 0,018, t тест ). ( D ) Связь между смертностью и тремя верхними и нижними квартилями экспрессии PMCA2 в подгруппе женщин с раком молочной железы в возрасте до 50 лет. По сравнению с тремя нижними квартилями для оценок PMCA2 AQUA, верхний квартиль экспрессии PMCA2 был значительно ниже. выживаемость (анализ Каплана-Мейера, P = 0.0120; Кокс непрерывный P = 0,0037; три нижних квартиля, n = 106; верхний квартиль, n = 35).

Избыточная экспрессия PMCA2 также изменяла внутриклеточные концентрации кальция в ответ на иономицин. Конфокальная кальциевая визуализация флуо-4 показала устойчивый рост внутриклеточных уровней кальция в контрольных клетках T47D / EV, обработанных иономицином (фиг. 4 C ). Это было связано с очевидным блеббингом плазматической мембраны во многих клетках, что согласуется с апоптотическим ответом.Однако в клетках T47D / PMCA2 иономицин вызывал лишь временное повышение внутриклеточных концентраций кальция (фиг. 4 C ). Считается, что одним из механизмов, посредством которого повышение внутриклеточного кальция вызывает апоптоз, является активация кальций-зависимого протеолитического фермента кальпаина (13). Поэтому мы исследовали активацию кальпаина в клетках T47D / PMCA2 и T47D / EV, подвергнутых воздействию кальция и иономицина. Как показано на фиг. 4 D , активность кальпаина была повышена в клетках T47D / EV в этих условиях, но не в клетках T47D / PMCA2.Интересно, что активность кальпаина также была повышена во время ранней инволюции, вызванной герметизацией сосков. Как показано на фиг. 4 E , активность кальпаина в незапечатанной железе, где уровни PMCA2 были высокими, была низкой. Однако в закрытой (инволюционной) железе, где уровни PMCA2 были низкими, кальпаин активировался через 24 часа. Следовательно, сверхэкспрессия PMCA2 снижает внутриклеточные уровни кальция и предотвращает активацию кальпаина и апоптоз в клетках рака молочной железы T47D. Наконец, было высказано предположение, что некоторые химиотерапевтические агенты, включая доцетаксел, вызывают апоптоз, отчасти за счет повышения уровня внутриклеточного кальция (28).Как показано на фиг. 4 F , клетки T47D / PMCA2 также продемонстрировали устойчивость к апоптозу в ответ на доцетаксел по сравнению с клетками T47D / EV.

Экспрессия PMCA2 предсказывает исход рака молочной железы.

Устойчивость к апоптозу — важный признак злокачественного прогрессирования (29). Учитывая, что PMCA2 изменяет чувствительность MEC и клеток рака груди к апоптозу, мы затем исследовали, коррелируют ли уровни PMCA2 с клинико-патологическими особенностями рака груди человека.Используя базу данных Oncomine и инструменты интеллектуального анализа данных (30), мы обнаружили, что высокая экспрессия мРНК PMCA2 была связана с более высокой степенью злокачественности опухоли (31) (рис. 5 A ) и более низкой 5-летней выживаемостью (32) (рис. 5 ). В ). Отражая наши результаты in vitro (фиг. 4 F ), мы также обнаружили, что экспрессия PMCA2 коррелировала с устойчивостью к доцетакселу у пациентов (33) (фиг. 5 C ). Затем мы окрасили тканевый микрочип (ТМА), состоящий из 652 первичных опухолей молочной железы, на PMCA2, используя автоматический количественный анализ (AQUA).Характеристики когорты пациентов показаны в таблице S1. Уровни PMCA2 положительно коррелировали с более высокой степенью опухоли, вовлечением лимфатических узлов и HER2-положительным статусом (Таблица S2). Типичные прогностические клинические маркеры, включая размер опухоли, узловой статус, ядерный класс и статус гормональных рецепторов (ER / PR), были достоверно связаны с выживаемостью по результатам одномерного анализа (Таблица S3). Экспрессия PMCA2 также обратно коррелировала с выживаемостью по результатам одномерного анализа ( P = 0,0089). Используя модель пропорциональных рисков Кокса, многомерный анализ (таблица S4) показал, что размер опухоли, узловой статус и баллы PMCA2 независимо связаны с выживаемостью ( P = 0.0489). Связь экспрессии PMCA2 с выживаемостью была более значимой для более молодых женщин в пременопаузе (в возрасте до 50 лет; характеристики этой когорты см. В таблице S1) со значением Kaplan-Meier P , равным 0,0120. В качестве непрерывной переменной уровни PMCA2 были связаны с выживаемостью у женщин в возрасте до 50 лет, но относительный риск был низким (непрерывный Кокса P = 0,0037, 1,042 относительный риск по одномерному анализу; P = 0,0027, 1,047 относительный риск по многомерному анализу. ).Однако, когда экспрессия была разделена на квартили, уровни PMCA2 стали надежно предсказывать выживаемость. На фиг. 5 D показан график Каплана-Мейера для выживаемости женщин в возрасте до 50 лет, с нанесением уровней PMCA2 в опухоли по квартилям. Как показано, у более молодых женщин с опухолями в наивысшем квартиле экспрессии PMCA2 наблюдалось резкое снижение выживаемости. Квартиль с наивысшей экспрессией PMCA2 в когорте <50 лет имел относительный риск смерти 2,475 ( P = 0,0015) по результатам одномерного анализа и 2.817 ( P = 0,0009) по результатам многомерного анализа по сравнению с остальной частью когорты. Применяя модель пропорциональных рисков Кокса только к женщинам в возрасте до 50 лет, многомерный анализ показал, что только PMCA2 оставался независимо связанным с выживаемостью ( P = 0,0009). Все другие маркеры потеряли значение, что свидетельствует о том, что уровни PMCA2 были более предсказуемыми для выживаемости пациентов у молодых женщин, чем стандартные прогностические маркеры, используемые в клинике. Наконец, поскольку уровни PMCA2 не зависели от статуса рецепторов эстрогена или прогестерона, но коррелировали со статусом HER2 (таблица S2), мы исследовали, коррелирует ли PMCA2 сильнее с выживаемостью у HER2-положительных пациентов.Во всей когорте уровни PMCA2 больше не позволяли прогнозировать выживаемость пациентов с HER2-отрицательными опухолями, но имели тенденцию прогнозировать смертность в HER2-положительных опухолях ( P = 0,08). Однако только у женщин до 50 лет прогностическая ценность PMCA2 не зависела от статуса HER2.

Обсуждение

Инволюция молочной железы запускается застоем молока и является одним из самых ярких примеров скоординированной гибели клеток в природе. Наши результаты предполагают, что важным событием в инициировании апоптоза является заметное изменение формы МЭК, которое, в свою очередь, связано с быстрым снижением уровней PMCA2 в клетках.Регулирование уровней PMCA2 с помощью застоя молока обеспечивает элегантный метод соединения секреторного процесса лактации с механизмом гибели клеток, необходимым для инволюции. По сути, подавляя PMCA2, длительное растяжение альвеол приводит к перегрузке кальциевой буферной способности клеток, вызывая устойчивое увеличение внутриклеточного кальция и апоптоз. Одним из эффектов повышенного содержания внутриклеточного кальция в МЭК, по-видимому, является активация активности кальпаина. Учитывая, что Stat5 и Stat3 являются субстратами для кальпаина (34, 35), и учитывая, что потеря PMCA2 связана с потерей ядерного фосфо-Stat5 и активацией Stat3, вполне вероятно, что повышение внутриклеточных уровней кальция при отъеме способствует изменения этих факторов транскрипции.

Помимо защиты МЭК от токсичности кальция во время лактации, мы обнаружили, что активность PMCA2 также защищает клетки рака груди от апоптоза. Это может объяснить, почему повышенная экспрессия PMCA2 связана с более крупными опухолями, более высокой степенью злокачественности и узловыми метастазами и предсказывает плохой исход у пациентов с раком груди. Интересно, что экспрессия PMCA2 коррелировала с экспрессией HER2 среди опухолей в когорте TMA. Поскольку HER2-положительные опухоли чаще встречались среди молодых женщин, это наблюдение может указывать на особенно очевидную связь между высоким уровнем PMCA2 и смертью у женщин в возрасте до 50 лет.Хотя экспрессия PMCA2 имела тенденцию прогнозировать смертность у женщин с HER2-положительными опухолями во всей когорте, эта связь не была достаточно статистически значимой ( P = 0,08). Эти результаты предполагают, что PMCA2 может быть особенно важным в биологии пременопаузального рака молочной железы и / или в HER2-положительных опухолях. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить, существуют ли биологические взаимодействия между передачей сигналов ErbB2 и PMCA2 в опухолях молочной железы.

Методы

Инволюция молока, вызванная застоем.

Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Йельского университета. Модель с уплотнением соски была выполнена, как описано Li et al. (2). Уровни мРНК и белка PMCA2 измеряли с помощью qRT-PCR и вестерн-блоттинга, как описано ранее (15). Иммуноокрашивание, морфометрические измерения и культура первичных эпителиальных клеток молочной железы мыши описаны в SI Text .

Анализ Deafwaddler-2J, мышей с дефицитом PMCA2.

Целые препараты молочной железы получали, как описано ранее (36).Ядра апоптоза метили с использованием DeadEnd Fluorometric TUNEL System (Promega). Апоптоз измеряли в 3D-культурах MMEC, используя ELISA ^PLUS (Roche). Концентрации внутриклеточного кальция визуализировали в MMEC на покровных стеклах в лактогенной среде с помощью конфокальной микроскопии живых клеток fluo-4 (Invitrogen) с использованием Zeiss LSM 510NLO и анализировали с помощью программного обеспечения Zeiss LSM и Volocity для анализа изображений (Improvision / Perkin-Elmer).

Сверхэкспрессия PMCA2 в клетках рака молочной железы T47D.

Генерация клеток T47D, сверхэкспрессирующих PMCA2 мыши, подробно описана в SI Text .

Микроматричный анализ тканей рака молочной железы.

Микроматрицы ткани карциномы молочной железы были сконструированы, как описано ранее (37). Анализ тканевых микрочипов и статистические методы описаны в SI Text .

Благодарности

Мы благодарим Эла Меннона за техническую помощь и Дэвида Така за полезные обсуждения. Эта работа финансировалась грантом DK069542 Национальных институтов здравоохранения (J.W.), грант Министерства обороны BC062952 (для J.V.) и Сьюзен Г. Комен для гранта KG081429 (для J.V.).

Сноски

• ¹ Кому следует направлять корреспонденцию. Электронная почта: john.wysolmerski {at} yale.edu.

• Вклад авторов: J.V. and J.W. спланированное исследование; J.V., C.S., C.B. и T.R. проведенное исследование; R.C. и D.L.R. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; J.V., C.S., C.B., R.C., D.L.R. и G.C. проанализированные данные; и J.V., C.S. и J.W. написал статью.

• Заявление о конфликте интересов: G.C. является консультантом HistoRx Inc. D.L.R. и R.C. являются учредителями, акционерами и консультантами HistoRx Inc.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Размещение данных: Последовательность, указанная в этой статье, была депонирована в базе данных GenBank (инвентарный номер GU734816).

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.0

  6107/-/DCSupplemental.

Рак груди у мужчин — NHS

Рак груди часто считается чем-то, что поражает только женщин, но мужчины могут заболеть им в редких случаях. Он растет в небольшом количестве ткани груди у мужчин за сосками.

Обычно это происходит у мужчин старше 60 лет, но иногда может поражать и более молодых мужчин.

Информация:

Консультации по коронавирусу

Получите консультацию о коронавирусе и раке:

Симптомы рака груди у мужчин

Симптомы рака молочной железы у мужчин включают:

• уплотнение в груди — обычно твердое, безболезненное и не движется внутри груди
• сосок, поворачивающийся внутрь
• жидкость, сочащаяся из соска (выделения из соска) , на котором могут быть прожилки крови
• болезненность или сыпь вокруг соска, которая не проходит
• сосок или окружающая его кожа становится твердой, красной или опухшей
• небольшие бугорки в подмышечной впадине (опухшие железы)

Подробнее о симптомах рака груди у мужчин.

Когда обращаться к вашему GP

Обратитесь к терапевту, если у вас есть:

• уплотнение в груди
• любые другие тревожные симптомы, такие как выделения из сосков
• наличие в анамнезе рака груди (у мужчин или женщин) у членов вашей семьи, и вы беспокоитесь о ваших шансах получить его

Очень маловероятно, что у вас рак, но лучше проверить свои симптомы. Ваш терапевт осмотрит вашу грудь и при необходимости направит вас на обследование и сканирование на рак груди.

Если у вас нет симптомов, но у вас есть четкая семейная история рака груди, ваш терапевт может направить вас к генетическому специалисту, чтобы обсудить ваш риск его заболевания.

Есть некоторые унаследованные гены, которые увеличивают риск рака, и для их проверки можно сделать анализ крови. Прочтите о тестировании генов риска рака.

Лечение рака груди у мужчин

Лечение рака груди у мужчин зависит от того, насколько далеко распространился рак.

Возможные методы лечения:

• операция по удалению пораженной ткани груди и соска (мастэктомия) и некоторых желез в подмышечной впадине
• лучевая терапия — при которой радиация используется для уничтожения раковых клеток
• химиотерапия — при использовании лекарств от рака для уничтожения раковых клеток
• другие лекарства, которые помогают остановить рост рака груди, в том числе тамоксифен и трастузумаб (герцептин)

Многие мужчины переносят операцию, за которой следует одно или несколько других методов лечения.Это может помочь остановить рецидив рака в будущем.

Узнайте больше о лечении рака груди у мужчин.

Перспективы рака груди у мужчин

Перспективы рака груди у мужчин зависят от того, насколько далеко он распространился к моменту постановки диагноза.

Рак груди можно вылечить, если он обнаружен на ранней стадии.

Излечение гораздо менее вероятно, если рак обнаружен после того, как он распространился за пределы груди. В этих случаях лечение может облегчить ваши симптомы и помочь вам прожить дольше.

Поговорите со своей медсестрой, занимающейся грудным вскармливанием, если вы хотите узнать больше о перспективах вашего рака.

Причины рака груди у мужчин

Точная причина рака груди у мужчин неизвестна, но есть некоторые факторы, повышающие риск его заболевания.

К ним относятся:

• гены и семейный анамнез — наследование ошибочных версий генов, называемых BRCA1 или BRCA2, увеличивает риск рака груди
• состояний, которые могут повышать уровень эстрогена в организме, включая ожирение, синдром Клайнфельтера и рубцевание печень (цирроз)
• предыдущая лучевая терапия в области грудной клетки

Не факт, что вы можете что-то сделать, чтобы снизить свой риск, но сбалансированное питание, потеря веса при избыточном весе и отказ от употребления слишком большого количества алкоголя могут помочь .

Последняя проверка страницы: 18 марта 2020 г.
Срок следующей проверки: 18 марта 2023 г.

сигнальных путей, участвующих в раннем морфогенезе молочных желез и раке молочной железы

Abstract

Спецификация судьбы эпителиальных клеток молочной железы происходит во время эмбриогенеза, когда клетки объединяются с образованием зачатка молочной железы. Внутри зародышевого зачатка молочной железы существует популяция эпителиальных клеток, которые впоследствии будут пролиферировать с образованием протокового дерева, заполняющего стромальный компартмент, и которые могут производить молоко при терминальной дифференцировке после рождения.Впоследствии эти структуры могут быть реконструированы и возвращены в исходное состояние после отлучения от груди перед восстановлением в будущих беременностях. Пластичность эпителиальной клетки молочной железы и ее чувствительность к рецепторам гормонов способствует этому удивительному биологическому подвигу, но аберрантная передача сигналов также может привести к непредвиденным последствиям в виде частых злокачественных новообразований. Отражая эту тесную связь, значительное количество сигнальных путей участвует как в морфогенезе, так и в канцерогенезе молочных желез.

Образец цитирования: Howard B, Ashworth A (2006) Сигнальные пути, участвующие в раннем морфогенезе молочных желез и раке молочной железы. PLoS Genet 2 (8):
e112.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0020112

Редактор: Элизабет М.К. Фишер, Университетский колледж Лондона, Соединенное Королевство

Опубликовано: 25 августа 2006 г.

Авторские права: © 2006 Howard и Эшворт. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Работа в нашей лаборатории поддерживается Исследовательским центром рака молочной железы «Прорыв».

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Как и многие другие органы, молочные железы образуются в результате обмена сигналами между эпителием и мезенхимой [1–3]. Однако процессы, с помощью которых недифференцированная ткань направляется на формирование эпителиального зачатка молочных желез во время эмбриогенеза, еще предстоит полностью выяснить.Неизвестно, как именно передается фенотип молочных желез, но похоже, что мезенхимальные сигналы вызывают локальную миграцию эпидермальных клеток с образованием зачатка молочных желез, а не через локализованную пролиферацию [4-6]. Как и в развитии всех эпителиальных придатков, плюрипотентные эпидермальные клетки направляются по определенным линиям, так что формируется специализированная структура, в данном случае молочная железа [7,8]. Фундаментальные процессы, необходимые для индуктивных событий развития зачатков молочных желез (миграция эпителия, изменения клеточной адгезии, рост, гибель и дифференцировка), также нарушаются при раке груди [9,10].Характеристика индуктивных сигнальных путей, участвующих в спецификации и формировании паттерна молочных желез, и регуляторных молекул, которые модулируют этот процесс, определит потенциальные мишени канцерогенеза молочной железы. Здесь мы выделяем самые ранние сигналы, обеспечивающие спецификацию молочных желез, и пытаемся консолидировать текущее понимание того, как действуют мезенхимальные факторы, чтобы вызвать начальные стадии развития зачатков молочных желез. Обсуждается взаимосвязь сигнальных путей, участвующих в нарушении регуляции рака.События на более поздних стадиях морфогенеза молочных желез недавно были подробно рассмотрены [11–14].

Развитие зачатков молочных желез у мышей

Эпителиальные зачатки молочных желез мышей обычно образуются в различных положениях вдоль оси тела и легко визуализируются путем окрашивания на экспрессию маркеров зачатков молочных желез, таких как Lef1, , сигнального компонента Wnt ниже по течению, или с помощью светового микроскопического анализа E12.5. Гистологический анализ сагиттальных срезов показывает первое появление зачатка молочной железы мыши у поздних E10 / ранних E11 эмбрионов [6] (Рисунок 1A).В это время отчетливые эллиптические агрегаты эпителиальных клеток видны на будущих участках зачатков 3 и 4 молочных желез, что определяется их положением относительно сомитов (Figure 1B). Однако сканирующая электронная микроскопия не выявляет явных признаков образования зачатка молочной железы [14] на этой стадии. К E11.5 (стадия ~ 48 сомитов) зачаток 3 выступает и при сканирующей электронной микроскопии наблюдается как небольшое возвышение над поверхностью эпидермиса [15]. Это первая пара зачатков молочной железы, обнаруживаемая на уровне всего эмбриона, причем зачаток 4 становится очевидным вскоре после зачатка 3.Псевдостратифицированный эпителий становится видимым, когда поперечные срезы будущего участка зачатка 3 анализируются на сходных стадиях [6,16]. Поскольку в презумптивной области молочной железы происходит небольшая локализованная пролиферация, предполагается, что эпителиальные клетки локально мигрируют или агрегируют с образованием зачатка, как это наблюдается у эмбрионов кроликов, где очевиден приподнятый гребень эпителиальных клеток, обладающих свойствами подвижных клеток, таких как ламеллоподии. [4–6,17]. После появления зачатка эллиптической формы клетки организуются в почку (Рис. 2A – 2E).Другой зачаток (1,2,5) становится морфологически отличным немного позже, и к E12 (52 сомита) все пять пар молочных зачатков становятся отчетливыми / видимыми.

Рисунок 1. Зачаток молочной железы

(A) Зачаток молочной железы 3 и 4 видны на E10.75 / E11.0 (38-40 сомитов) на гистологических сагиттальных срезах эмбрионов мыши, окрашенных гематоксилином.

FL, зачаток передних конечностей; HL, зачаток задней конечности; MLM, мезенхима линии молочных желез; NT, нервная трубка

(B) Более высокое увеличение области молочной железы из (A).Анлаген 3 и 4 при большем увеличении.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0020112.g001

Рис. 2. Гистологические срезы зачатка молочных желез 4, окрашенные гематоксилином

(A) Поздние E10 / E11, когда клетки первоначально собираются в эллиптическую форму.

(B) E11.5 Утолщение эпидермиса.

(В) Е12.0 на бугорке.

(D) E13.0 на стадии шаровидной почки.

(E) E14.5 на стадии лампочки.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.0020112.g002

Стволовые клетки молочных желез

Внутри зачатка существует популяция эпителиальных клеток, стволовых клеток, способных к самообновлению и генерированию дочерних клеток, которые могут дифференцироваться по различным клеточным линиям, так что все типы клеток зрелой молочной железы могут образовываться. . Эпителиальные зачатки молочных желез могут быть изолированы и трансплантированы в жировые подушечки, которые были «очищены» от всех эпителиальных протоковых элементов [18]. Этот метод используется экспериментально для изучения разрастания протоков молочной железы на моделях мутантных мышей, которые демонстрируют эмбриональную летальность и которые иначе не поддаются анализу фенотипа молочных желез [19,20].Из зачатков молочной железы, эксплантированных на ст. E12.5, обычно образуется проток со всеми нормальными характеристиками молочной железы, за исключением отсутствия соска. Эти эксперименты подтверждают существование определенной популяции стволовых клеток молочной железы, совпадающей с появлением зачатка молочной железы на E12.5.

У взрослых популяция стволовых клеток молочной железы была недавно очищена, но связь этой популяции постнатальных клеток с «эмбриональными» стволовыми клетками еще не установлена ​​[21,22]. Считается, что помимо способности к самообновлению, эпителиальные стволовые клетки молочных желез обладают присущим им опухолевым потенциалом по мере того, как последующее развитие молочных желез продолжается и продолжается постнатально.Поскольку повреждения ДНК и мутации могут накапливаться на протяжении всего постнатального развития, те клетки-предшественники, на которые негативно влияют генетические изменения, могут сохраняться на протяжении всей жизни человека. Это эффективно создает популяцию клеток, несущих потенциально вредные генетические изменения, нестабильности и модификации — предполагаемые стволовые клетки рака груди [23,24]. Как клетки-предшественники молочных желез приобретают свойства, которые позволяют им постоянно сообщать идентичность молочных желез их потомству, и как поддерживается фенотип молочных желез, еще предстоит решить, но эти процессы начинаются во время эмбрионального морфогенеза молочных желез.

Мезенхима молочной железы может передавать судьбу эпителиальных клеток молочной железы

Точный момент времени, в который эпителий молочной железы приобретает регенеративную способность, еще не определен, но, вероятно, он совпадает со спецификацией зачатка молочной железы. Эпителий, выделенный из молочных желез на всех последующих стадиях, сохраняет способность генерировать протоковый отросток [25,26]. Постоянная потребность в поддержании судьбы клеток молочных желез за пределами стадий зачатка и зачатка указывается при исследовании нескольких моделей мышей, которые формируют зачатки молочных желез, которые не развиваются после стадии зачатка [27,28].Кроме того, реверсия фенотипа молочной железы может происходить до E15.5, как показано в исследованиях индуцибельных моделей PthrP на мышах [29]. К E13 определяется эмбриональный эпителий молочных желез, а к E17 он становится преданным судьбе молочных желез, как продемонстрировано исследованиями тканевой рекомбинации [30,31]. Следует также отметить, что помимо стимулирования судьбы молочных плакод, вероятно, существуют факторы, которые ингибируют судьбу молочных плакод. Судьба соседних клеток, вероятно, будет определяться существованием соседнего зачатка молочной железы.

Эксперименты по рекомбинации тканей продемонстрировали индуктивную способность мезенхимы молочной железы [1,32,33]. В этих экспериментах эпителий из различных немаммарных участков (дорсальный, вентральный) был индуцирован для образования ткани молочной железы при рекомбинации с предполагаемой мезенхимой молочной железы (из эмбрионов кролика, которые образуют приподнятый эпидермальный гребень, линию молочных желез, до образования зачатка [33]. ]) и мезенхимы молочной железы (от эмбриональной мезенхимы мыши, крысы или кролика, смежной с эпителиальным зачатком молочной железы) [14,32,34].Эти результаты показывают, что мезенхимные клетки вдоль линии молочных желез обладают сигнальными / индуктивными свойствами, как и мезенхима молочных желез, связанная с зачатками молочных желез. Вторичная мезенхима молочной железы (будущая жировая прослойка) не обладает этой индуктивной способностью. Это говорит о том, что существует окно, в котором индуктивные свойства существуют в мезенхиме молочной железы. Гиперпластический рост происходит, когда эмбриональная мезенхима молочной железы рекомбинируется с постнатальным эпителием молочной железы [31,35]. Это демонстрирует потенциально пагубное влияние эмбриональных регуляторов молочной железы на постнатальные эпителиальные популяции молочных желез.

Основные сигнальные регуляторы образования зачатков молочных желез также играют роль в раке молочной железы

Недавно было идентифицировано несколько мезенхимальных сигналов, которые регулируют начальные стадии развития молочных желез и вызывают локальную миграцию и изменения клеточной адгезии эпителиальных клеток (Рисунок 3). Напр., Передача сигналов Fgf10 через Fgfr2b необходима для инициации зачатка молочных желез за исключением 4 зачатка молочных желез, который может формироваться в отсутствие лиганда или рецептора [15].MMTV-опосредованный инсерционный мутагенез идентифицировал Fgfs как частые мутационные события в индуцированных ретровирусом опухолях молочной железы мышей; активация Fgf3, Fgf4, и Fgf8 кооперируется с сигналами Wnt в опухолевом генезе молочной железы мышей [36,37]. Более того, Fgf10 также может действовать как онкоген у мышей [38]. Повышенные уровни FGF10, наблюдаются примерно в 10% случаев рака груди человека [38], а амплификация и сверхэкспрессия нескольких FGFR, включая FGFR1, FGFR2, и FGFR4, наблюдаются при раке груди [39–44]. ].FGFRs играют хорошо изученную роль в ангиогенезе и миграции клеток [45,46], а передача сигналов FGFR способствует пролиферации клеток рака груди [47]. Помимо стимулирования пролиферации, передача сигналов Fgfr1 вносит вклад в потерю клеточной полярности и продвижение инвазивных свойств, таких как индукция Mmp3 в трехмерной модели in vitro эпителиальных клеток HC11 молочной железы мышей [48]. У трансгенных мышей устойчивая активация FGFR1 вызывает альвеолярную гиперплазию и инвазивные поражения молочных желез [49].Более того, блокирование передачи сигналов FGFR с помощью селективного ингибитора активности тирозинкиназы FGFR ингибирует пролиферацию клеток рака молочной железы за счет подавления некоторых членов семейства CyclinD [47]. Поскольку считается, что высокие уровни CyclinD1 непосредственно влияют на онкогенность, ингибирование передачи сигналов FGFR, вероятно, будет полезным терапевтическим подходом для лечения некоторых видов рака молочной железы.

Рис. 3. Выражение основных регуляторов образования зачатка молочных желез

60-мкм поперечные сечения вибратома через участок, где впоследствии будет формироваться зачаток 3.Экспрессия Fgf10 и Tbx3 наблюдается в дермамиотоме вдоль линии молочной железы у эмбрионов сомита E10.5 / 32 на стадии B6. Эти паттерны экспрессии сохраняются до тех пор, пока зачаток не станет морфологически отличным. Nrg3 широко экспрессируется в латеральной пластинке мезодермы, прилегающей к сомиту E10.75 37 сомитов стадии B6 эмбрионов, лежащих в основе будущего сайта зачатка 3. Экспрессия Wnt (визуализирована с использованием линии BAT-GAL репортерных мышей Wnt [124]) наблюдается в сомите и будущей зачатке молочной железы 3 сайте E10.75 37 эмбрион на стадии сомита. Как эпителиальная (стрелки), так и мезенхимальная экспрессия Wnt наблюдается вдоль линии молочных желез. Выражение по предполагаемой линии молочной железы обведено рамкой.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0020112.g003

Tbx3 представляет собой репрессор транскрипции, который принадлежит к подсемейству Tbx2 / 3/4/5 регуляторов транскрипции T-box [50]. TBX3 мутирован при синдроме локтевой молочной железы, заболевании человека, которое нарушает развитие апокринных желез и конечностей [51].Модель нокаута Tbx3 у мышей демонстрирует потребность в Tbx3 для инициации зачатка молочных желез, с незначительной оговоркой, что иногда у этих мышей может формироваться один единственный зачаток молочных желез [52]. Передача сигналов через Fgfr1 участвует в индукции экспрессии Tbx3 [53]. Другая интересная роль Tbx3 была продемонстрирована с использованием Tbx3 , ретровирусно доставленных куриным эмбрионам [54]. Эти эксперименты подтверждают, что наряду с dHand и Gli3, Tbx3 может модулировать положение зачатков конечностей вдоль передне-задней оси [54].Хотя это предположение, это привлекательная идея, что подобный механизм может действовать в генезе молочной железы, посредством чего Tbx3 и др. Факторы определяют будущее расположение зачатков молочных желез вдоль оси тела.

TBX3 сверхэкспрессируется в некоторых клеточных линиях рака молочной железы [55], а высокие уровни экспрессии укороченной формы TBX3 обнаруживаются в плазме больных раком молочной железы на ранней стадии [56]. Подобно Tbx3, Tbx2 первоначально экспрессируется в мезенхиме вдоль презумптивной линии молочных желез до образования зачатка. Tbx3 (но не Tbx2 ) экспрессируется в эпителиальном компартменте формирующегося зачатка [57]. Наряду с Tbx2, Tbx3 может репрессировать гены старения, инактивируя путь ответа p53 [55]. Путь p19 (ARF) -Mdm2-p53 регулирует клеточный цикл и защищает клетки от онкогенной трансформации, а Tbx3 сильно подавляет экспрессию как мышиного p19 (ARF), так и человеческого p14 (ARF) [58]. Хотя Tbx2 -null мыши не обнаруживают дефектов в инициации развития молочной железы, дефекты поддержания плакод более серьезны у двойных гетерозигот для Tbx2 и Tbx3 , чем у мышей с гетерозиготами Tbx3 [57].Это исследование также показало, что во время раннего развития зачатка молочных желез взаимодействие Tbx2 и Tbx3 опосредуется через p19Arf / p53-независимый путь.

Сигналы

Wnt являются критическими для индукции молочных желез, а трансгенные мыши, экспрессирующие антагонист Wnt Dkk1, в развивающемся эпителии, не продуцируют зачатков молочных желез [59]. Lef1 необходим для образования зачатков 2 и 3 молочных желез [60]. Другой зачаток (1, 4 и 5) формируется у мышей Lef1 -null и затем не может продвигаться дальше E13.5 стадия бутона. Агрегаты Wnt-экспрессирующих эпителиальных и мезенхимальных клеток обнаруживаются в презумптивной области молочной железы у эмбрионов E10.5 [17,61]. Плакоды молочных желез, по-видимому, образуются из агрегации эпителиальных клеток, экспрессирующих по крайней мере один Wnt, включая Wnt10b, , который, по-видимому, соединяет формирующийся зачаток 2, 3, 4 и 5 вдоль молочной линии [16,17,62]. Кажется правдоподобным, что эти Wnt-экспрессирующие / Lef1-чувствительные клетки являются мишенями для мезенхимальных сигналов, генерируемых Tbx3 и Fgf10 вдоль предполагаемой линии молочных желез, или что эти сигналы индуцируют экспрессию Wnt в этих эпителиальных клетках вдоль участков, где молочные железы форма зачатка.Однако идентичность Wnt или Wnts , участвующих в индуктивных событиях в молочных железах, неизвестна, как и требуется ли экспрессия Wnt в эпителиальных или мезенхимальных клетках или в обоих [17].

Wnts, которые, вероятно, участвуют в спецификации и раннем морфогенезе молочных желез, такие как Wnt3a, Wnt6, и Wnt10b, также генетически изменены в MMTV-индуцированных опухолях молочной железы [17,63]. WNT3A, WNT4, WNT6, WNT8B, WNT9A, и WNT10B все сверхэкспрессируются во многих клеточных линиях рака молочной железы [64].Эти WNT передают сигнал через канонический путь передачи сигналов WNT / β-catenin. Сверхэкспрессия β-catenin и CyclinD1 наблюдается в некоторых линиях клеток рака молочной железы и в большом проценте случаев рака молочной железы, но не в эпителиальных клетках молочной железы человека, что указывает на то, что каноническая передача сигналов WNT / β-catenin активируется во время канцерогенеза [65]. WNT1, WNT4, и компоненты пути Wnt AXIN2 и LEF1 активируются при раке груди [66]. Рецепторы Frizzled 1 и 2 (FZD1 и FZD2) также сверхэкспрессируются при раке груди [67], а высокая активность β-катенина значительно коррелирует с плохим прогнозом у пациентов с раком груди [65].Увеличение передачи сигналов WNT1 в эпителиальных клетках молочной железы человека запускает ответ на повреждение ДНК и способствует опухолевой конверсии посредством Notch-зависимого процесса [66]. Хотя мутации в вышестоящих сигнальных компонентах WNT не наблюдались при раке груди, инактивирующие мутации APC наблюдаются в некоторых опухолях груди человека, и они, вероятно, увеличивают стабильность β-catenin [68]. Хотя о таких мутациях у человека не сообщалось, мышиные модели, которые экспрессируют стабилизированный β-catenin (путем мутации N-терминального домена) в просветных или миоэпителиальных клетках молочных желез, образуют карциномы молочных желез [69,70].

антагонисты WNT могут действовать как опухолевые супрессоры и вызывать конститутивную активацию передачи сигналов WNT при мутации; сниженная экспрессия секретируемых ингибиторов WNT SFRP1 и WIF1 наблюдалась при раке груди [71–73]. Недавнее исследование 24 первичных форм рака молочной железы показало, что 67% были аберрантно метилированы в промоторе WIF1; это коррелировало со снижением экспрессии в образцах опухоли по сравнению с нормальной тканью [73]. Подавление экспрессии SFRP1 также наблюдается в значительной части инвазивного рака груди и часто происходит из-за аберрантного гиперметилирования промотора [74,75]. SFRP1 инактивация при раке груди связана с плохим прогнозом [75,76].

Модели мышей MMTV-Wnt1 и MMTV-Wnt10b демонстрируют преждевременное развитие долек-альвеол, так что концы протоков проявляют фенотипы, сходные с теми, которые обычно наблюдаются во время беременности у небеременных самок и самцов мышей [77,78]. У этих мышей гиперплазии и аденокарциномы развиваются с очень высокой частотой и с коротким латентным периодом. Трансгенные мыши с промотором MMTV-LTR , управляющим активированной формой β-catenin, обладают сходным фенотипом и подтверждают представление о том, что онкогенные пути WNT действуют через β-catenin [79].Одним из возможных объяснений наблюдаемых агрессивных фенотипов опухолей является то, что опухоли MMTV-Wnt содержат увеличенную популяцию предшественников / стволовых клеток [21,80]. Было высказано предположение, что индуцированная WNT амплификация предшественников, вероятно, является ключевым событием в инициации опухоли [81]. Новые терапевтические стратегии могут быть разработаны путем нацеливания на пути, которые модулируют популяции предшественников в молочной железе.

Мутация scaramanga (ska) является полезной моделью для выяснения молекулярных механизмов, которые управляют спецификацией фенотипа молочной железы.Мутация ska нарушает некоторые из самых ранних аспектов развития молочных желез [82,83]. Зачаток 3 часто не формируется или гипопластичен, а эктопические зачатки молочных желез формируются рядом с зачатком 4 с высокой частотой. Наблюдаются также более тонкие дефекты размера, формы и положения зачатка молочной железы, так что стереотипное положение пяти пар молочных зачатков редко наблюдается, когда маркеры зачатков молочных желез используются для визуализации зародышевых зачатков. Фенотипы молочной железы, наблюдаемые у мутантов ska , согласуются с аномальными индуктивными событиями, происходящими до морфологического появления зачатка молочной железы.

Позиционное клонирование идентифицировало ген, пораженный у мутантов scaramanga ( ska) , как Neuregulin3 ( Nrg3 ) [61]. Nrg3 является плохо охарактеризованным членом важной сигнальной сети и экспрессируется при некоторых преинвазивных и инвазивных формах рака груди [84,85]. Nrg3 кодирует фактор роста, который связывает и активирует рецептор тирозинкиназы Erbb4 [86]. Erbb4 регулирует как пролиферацию клеток, так и терминальную дифференцировку в молочных железах [87–89].Предпочтительным партнером по гетеродимеризации для Erbbs (включая Erbb4) является Erbb2, который имеет глубокие связи с раком груди и который терапевтически нацелен с положительными клиническими результатами [90]. Erbb4 также модулирует миграцию клеток в развивающейся нервной системе. Nrg3 экспрессируется в переднем мозге крыс вместе со многими др. Связанными с Egf лигандами, а миграция и размещение нейробластов в переднем мозге крыс опосредуется Erbb4 [91]. Передача сигналов Erbb4 контролирует индуцированную Nrg1β1 миграцию в нейральных клетках-предшественниках, а также опосредует организацию и пролиферацию клеток в субвентрикулярной зоне, нейрогенной области переднего мозга взрослого человека [92,93].Другой лиганд для Erbb4, Nrg1, может индуцировать миграцию рака груди, меланомы и клеток in vitro [94,95]. Следовательно, вероятно, что контроль миграции предшественников эпителия молочных желез модулируется с помощью передачи сигналов Nrg-Erbb.

Локализованная экспрессия Nrg3 в презумптивной области молочных желез до морфологического появления зачатков и экспрессия эпителиальных маркеров зачатков предполагает индуктивную роль. Молочные зачатки появляются в сайтах, где локализуются Fgf10, Tbx3, и Wnt и Nrg3 , Erbb4 (т.е.е., вдоль линии молочной железы) в латеральной пластинке и покрывающей ее мезодерме (Рисунок 3). Эта совпадающая экспрессия Tbx3, Fgf10, Nrg3, и Wnts в эмбриональной мезенхиме происходит непосредственно перед определением от эмбриональной эктодермы к эпителию молочных желез, а не остается простой эпителиальной судьбой. Эктопические плакоды молочных желез могут быть индуцированы в культурах эксплантатов путем размещения пропитанных rNrg3-Egf шариков рядом с плотной мезенхимой вдоль линии молочных желез, которая маркируется экспрессией Fgf10, Tbx3 и Wnts .Эти результаты показывают, что Nrg3 является сигналом спецификации для молочных желез [61].

Похоже, что индукционная мезенхима линии молочных желез (которая представляет собой ткань из предполагаемой области молочной железы, которая экспрессирует Tbx3, Fgf10, и Nrg3 ), в сочетании с другим эпителием (которые экспрессируют Fgfr2B и Erbb рецепторов). Как сигналы от Fgf10 и Tbx3 (и, возможно, мезенхимальных Wnts) передаются от латеральной пластинки мезодермы к популяции предшественников эпителия, неизвестно, но Nrg3 является привлекательным кандидатом для передачи этого сигнала (Рис. 4).На стадиях, предшествующих морфологическому появлению зачатка, Nrg3 локализуется в мезенхиме, прилегающей к будущему участку зачатка (стадия сомита 35–47). На стадии, когда плакода 3 изначально выявляется с помощью сканирующей электронной микроскопии (стадия 47 сомитов), Nrg3 сначала экспрессируется на базальном крае эпителия зачатка, а позже все клетки собственно эпителиального зачатка молочных желез экспрессируют Nrg3. Erbb4 и Erbb4 экспрессируются аналогичным образом. Экспрессия Erbb2 также экспрессируется в эпителии и мезенхиме ранних зачатков молочных желез, прежде чем ограничиться зачатком.Пропитанные Fgf10 шарики, имплантированные в эксплантированные эмбрионы мыши, не влияли на экспрессию Lef1 или морфологию эпидермиса [15]. Следовательно, вероятно, что для передачи сигналов, генерируемых Fgf10, необходимы другие факторы. Когда пропитанные Fgf8 шарики имплантировали в эксплантированные эмбрионы мыши, наблюдалась повышенная экспрессия как Tbx3 , так и Lef1 в окружающей мезенхиме, но не было морфологических изменений в эпителии [53]. В то время как зачаток молочных желез изначально виден, экспрессия Tbx3 сдвигается с мезенхимы линии молочных желез на эпителиальный компонент [53].Наблюдалось увеличение как эпителиальной, так и мезенхимальной передачи сигналов Wnt у Wnt репортерных мышей, когда пропитанные rNrg3 шарики имплантировали в эксплантированные мышиные эмбрионы после 24 часов культивирования [61]. Кроме того, эпителиальные агрегаты часто обнаруживаются рядом с пропитанными Nrg3 гранулами, это указывает на то, что эктопическая экспрессия Nrg3 может влиять на инициацию образования зачатка молочных желез. Эти функциональные исследования и локализация экспрессии Nrg3 между сайтами экспрессии Fgf10 и Tbx3 в мезодерме латеральной пластинки и вышележащих эпителиальных клетках, экспрессирующих Wnt, подтверждают модель, согласно которой Nrg3 передает сигналы ниже Tbx3 и Fgf10 в вышележащий эпителий, чтобы влиять на их локальную агрегацию [61] (Рисунок 4).Хотя эта модель полезна в качестве гипотезы, она явно упрощена, поскольку явно задействованы другие факторы. Tbx3 и Fgf10 могут влиять на передачу сигналов Wnt независимо от Nrg3. Генетические иерархии и точные отношения между Fgf10, Nrg3, Tbx3 и Wnts еще предстоит полностью выяснить, как и роль каждого из них в эпителиальном и мезенхимальном компартментах.

Рисунок 4. Модель образования зачатка молочной железы и определения клеточной судьбы

Эта модель основана на функциональных исследованиях, а также на моделях экспрессии Fgf10, Nrg3, Tbx3, и Wnts в предполагаемой области молочной железы между E10 и E11 при инициации. вероятны процессы.Генерируются неизвестные осевые сигналы, так что зачаток молочных желез возникает в определенных местах вдоль передне-задней, дорсально-вентральной оси. Речь идет о других факторах, и генетические требования, вероятно, будут различаться для каждой из пяти пар зачатков. Например, Fgf10 не требуется для начального образования зачатка 4, поэтому эта упрощенная модель применима к зачатку 1, 2, 3 и 5.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0020112.g004

Было продемонстрировано различное влияние дефицита Fgf10, Lef1, и Tbx3 как на зачаток молочной железы, так и на развитие специфического зачатка в протоке [15, 57,60].Как эти и другие гены вносят вклад в формирование специфического зачатка вдоль оси тела, не совсем понятно, но становится все более очевидным, что разные гены регулируют начальное образование отдельного зачатка [16]. Сайт между зачатком 3 и 4, по-видимому, очень чувствителен к уровням фактора роста, как показали исследования моделей мышей Nrg3 и Eda-A1 [96]. Временная последовательность начальной экспрессии разных генов в каждом зачатке эпителия молочных желез не идентична, также подтверждая, что каждый может вносить вклад в начальное образование зачатка вдоль оси тела по-разному [15,53,57].Также неизвестно, как осевые сигналы передаются к будущим участкам зачатка молочной железы. Экспрессия основных регуляторов самых ранних стадий морфогенеза молочных желез динамична, и в случае Tbx3 и Nrg3, переключаются с мезенхимы на эпидермис в то время, когда зачаток изначально очевиден. Изменение экспрессии может отражать сдвиг к отдельным функциям этих генов на более поздних стадиях морфогенеза молочных желез.

Eda and Edar

Мутации в компонентах пути эктодисплазина приводят к эктодермальной дисплазии как у людей, так и у мышей [97].В дополнение к аномалиям кожи, волос, зубов и потовых желез, гипогидротическая эктодермальная дисплазия иногда связана с отсутствием сосков [98]. Tabby и downless — модели мышей с мутациями в Eda и Edar, соответственно. Первоначальное образование зачатка молочной железы, по-видимому, протекает нормально в этих моделях, хотя ни одна из них еще не была тщательно проанализирована (Marja Mikkola, личное сообщение). Модель на мышах K14-Eda-A1 демонстрирует развитие эктопического эпителиального зачатка молочной железы и, вероятно, обеспечивает молекулярную связь между результатами, наблюдаемыми в различных моделях мышей, описанных выше, которые демонстрируют аномальную индукцию молочной железы [96,99].У мышей K14-Eda-A1 пять эндогенных пар молочных зачатков развиваются в своих стереотипных положениях. Дополнительные зачатки молочных желез и соски также развиваются вдоль «линии молочных желез» и в основном между участками зачатков 3 и 4. Eda является мишенью передачи сигналов Wnt, а Lef1 связывается с участком внутри промотора Eda , увеличивая транскрипцию ген [100]. Eda-A1, вариант сплайсинга, продукт которого связывает Edar, как полагают, способствует участию плакод, поскольку в этой модели на мышах также наблюдаются дополнительные зубы и увеличенные волосяные фолликулы.Передача сигналов через Eda-A1 и Edar опосредуется NF-κB, который часто аномально активируется при раке груди [101] .

Other Genetic Pathways

Многие другие генетические пути способствуют раннему развитию зачатка молочных желез. Эпителий не может расслаиваться, и зачатки молочных желез или др. Эпидермальные придатки не образуются у мышей p63 -null [102,103]. p63 регулирует несколько сигнальных путей, необходимых для развития эпидермиса. β -catenin и Fgr2b подавляются в эпителии p63 -null, что может объяснять затрудненный морфогенез молочных желез [104].Небольшое утолщение эпителия происходит у мышей, у которых как Msx1 , так и Msx2 инактивированы, но не имеют отчетливых форм зачатка молочных желез. Инактивация либо Msx1 , либо Msx2 сама по себе не влияет на образование зачатка [105]. И Msx1 , и Msx2 могут активировать экспрессию CyclinD1 [106]. Передача сигналов Notch действует на клетки-предшественники молочных желез и способствует самообновлению и клон-специфической дифференцировке судьбы миоэпителия [107].Ежики также участвуют в самообновлении и поддержании популяции предшественников молочных желез [108]. Исследования ролей Ihh и Shh в развитии зачатка молочных желез показывают, что они не требуются или что генетическая избыточность может скрывать эффекты потери того или другого [20,109]. Gli3 ^xt мышей, нулевой аллель Gli3 (фактор транскрипции, который формирует компонент пути Hh), неспособны формировать зачатки 3 и 5 [110].Передача сигналов Hh, по-видимому, блокируется у мышей Lef1 -null, поскольку экспрессия Ptch2 (который является одновременно рецептором Hh и транскрипционной мишенью Hh) снижается в мезенхиме молочной железы мышей Lef1 -null [60] . Недавнее исследование экспрессии SHH, PTCh2 и GLI1 в 52 раковых опухолях молочной железы показало, что эти компоненты пути Hh часто активируются по сравнению с соседней нормальной тканью [111].

Передача сигналов Nodal регулирует многие процессы развития, включая дифференцировку, формирование зародышевых листков и спецификацию переднезадней и лево-правой осей и средней линии эмбриона [112].Nodal действует через путь TGF-β / активин, связываясь с Acvr2b, рецептором активина типа II. Cripto действует как важный кофактор для пути Nodal. Cripto -null мыши лишены примитивной полоски и неспособны формировать мезодерму [113], фенотип, общий для мышей, лишенных Acvr1b, Acvr2a, Acvr2b, или Nodal . CRIPTO сверхэкспрессируется в карциномах груди, яичников, желудка, легких и поджелудочной железы [114]. И Cripto , и Nodal экспрессируются в недифференцированных ES-клетках человека и мыши и, как полагают, способствуют поддержанию плюрипотентности [115,116].Cripto и Nodal оба являются кандидатами в морфогены молочных желез, хотя ранние эмбриональные летальные фенотипы запрещают изучение фенотипов зачатков молочных желез [117].

Похоже, что окно развития существует, когда мезенхима экспрессирует факторы, которые необходимы для передачи судьбы эпителия молочных желез избранной группе недифференцированного эпителия. Неясно, как именно сходятся сигнальные пути, чтобы вызвать программу развития эпителия молочных желез. Выяснение генетической иерархии и способа взаимодействия различных сигнальных молекул в контексте спецификации молочной железы позволит интегрировать пути, которые, как известно, не регулируются при раке груди человека [4,12,33,38,54,56,77,111,118–123 ].

Заключение

Лучшее понимание генетических путей, вовлеченных в ранний морфогенез молочной железы, вероятно, будет иметь серьезные последствия для рака груди. Дальнейшее определение сигналов, которые запускают дифференцировку молочных желез, должно проложить путь для разработки новых терапевтических и профилактических стратегий. По мере открытия большего количества маркеров стволовых клеток молочной железы и анализа генетических моделей раннего морфогенеза молочных желез вопрос о том, как можно выбрать недифференцированную эпидермальную клетку, чтобы она стала строительным блоком для одного из самых интересных органов, станет все ближе к ответу.

Дополнительная информация

Регистрационный номер

Национальный центр биотехнологической информации EntrezGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene) номера доступа для генов и белков, обсуждаемых в этой статье: Acvr1b (11479 ), Acvr2a (11480), Acvr2b (11481 ) , APC (324), AXIN2 (8313), β-катенин (1499), CRIPTO (6997), 12627), CyclinD1 (595), CyclinD1 (12443), dHand (15111), Dkk1 (13380), Eda (13607), Edar (13608), Erbb2 (138664) ( Erbb) 13869), Fgf3 (14174), Fgf4 (14175), Fgf8 (14179), FGF10 (2255), FGF10 (14165), FGFR1 (14182), 14182 (22) FGFR1 (22) Fgfr2b (14183), FGFR2 (2263), FGFR4 (2264 ) , FZD1 (8321), FZD2 (2535), GLI1 (2735), Gli3 (1463414), (16h) LEF1 9072 6 (51176), Lef1 (16842), Mdm2 (17246), Mmp3 (17392), Msx1 (17701), Msx2 (17702), NF-κB (4790), Nodal (18119), Nodal (18119) NRG1 (3084), Nrg1 (112400), Nrg3 (18183), p14 (ARF) (1029), p19Arf (12578), p53 (22059), p63 (22061), Ptch2 (19206), PTCh2 (5727 ), PthrP (19227), SFRP1 (6422), SHH (6469), Shh (20423), TBX3 (6926), Tbx3 (21386), WIF1 (11257) WNT1 (7471), Wnt1 (22408), WNT3A (89780), Wnt3a ( 22416), WNT4, (54361), WNT6 (7475256), WNT8B (7479), WNT9A (7483), WNT10B (7480) и Wnt10b (22410).